| 脉冲场凝胶电泳 |
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作者:佚名 文章来源:本站原创 点击数: 更新时间:2007-1-14 12:37:48  |
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1)高分子量DNA琼脂糖凝胶块制备和加工
1.收集10ml全血,加入30ml细胞裂解液。置冰浴中至少20min直至红细胞完全溶解。
2.2000r/min离心10min,移去红色上清液,再次用细胞裂解液洗涤细胞,然后用PBS重悬细胞。
3.稀释单细胞悬液并取一小份用Neubauer腔计数细胞。
4.用PBS重悬细胞,以达到40μl PBS中含1百万个细胞比例(1百万个二倍体哺乳动物大约含有基因组DNA 10μg)
5.用PBS配制2%浓度低熔点琼脂糖溶液并保持在50℃。
6.将等体积(各1ml)细胞悬液与琼脂糖溶液于室温下混匀,立即倒入凝胶块模具中。
7.静置20min让琼脂糖固化,用无菌塑料杯(通常用作划菌)将凝胶块自模具中取出并置入蛋白酶缓冲液中,加入2mg/ml的蛋白酶K。
8.将带有凝胶块的蛋白酶K缓冲液于50℃保持2~3天。每个盛有50ml蛋白酶缓冲液的Falcon管可容纳多达100个凝胶块。
9.蛋白酶K消化后,可将凝胶块保留在此缓冲液或0.5mol/L EDTA溶液中保存于4℃。
10. 此外,继续将凝胶块用高压消毒过的TE缓冲液冲洗数遍的步骤。
11. 将凝胶块放入装有TE及0.04mg/ml PMSF溶液的Falcon试管中,灭活残留的蛋白酶K。
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| 文章录入:21jxhg 责任编辑:21jxhg |
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