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脉冲场凝胶电泳       ★★★
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脉冲场凝胶电泳
作者:佚名 文章来源:本站原创 点击数: 更新时间:2007-1-14 12:37:48

1)高分子量DNA琼脂糖凝胶块制备和加工

1.收集10ml全血,加入30ml细胞裂解液。置冰浴中至少20min直至红细胞完全溶解。

2.2000r/min离心10min,移去红色上清液,再次用细胞裂解液洗涤细胞,然后用PBS重悬细胞。

3.稀释单细胞悬液并取一小份用Neubauer腔计数细胞。

4.PBS重悬细胞,以达到40μl PBS中含1百万个细胞比例(1百万个二倍体哺乳动物大约含有基因组DNA 10μg

5.PBS配制2%浓度低熔点琼脂糖溶液并保持在50℃。

6.将等体积(各1ml)细胞悬液与琼脂糖溶液于室温下混匀,立即倒入凝胶块模具中。

7.静置20min让琼脂糖固化,用无菌塑料杯(通常用作划菌)将凝胶块自模具中取出并置入蛋白酶缓冲液中,加入2mg/ml的蛋白酶K

8.将带有凝胶块的蛋白酶K缓冲液于50℃保持23天。每个盛有50ml蛋白酶缓冲液的Falcon管可容纳多达100个凝胶块。

9.蛋白酶K消化后,可将凝胶块保留在此缓冲液或0.5mol/L EDTA溶液中保存于4℃。

10.  此外,继续将凝胶块用高压消毒过的TE缓冲液冲洗数遍的步骤。

11.  将凝胶块放入装有TE0.04mg/ml PMSF溶液的Falcon试管中,灭活残留的蛋白酶K


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